由于農業施肥的不合理使用和生活污水、工業污水、養殖污水、農田徑流的直接排放，大量氮、磷等營養物質被排入自然水體，對水生生態系統的結構和功能構成嚴重威脅。目前，污水處理廠被認為在控制污染和改善水質方面起著舉足輕重的作用。然而，經過生物處理后的污水處理廠廢液中仍有約10-15 mgL?1的氮殘留，如果不經任何深度處理直接排放，可能導致富營養化。因此，迫切需要有效的污水處理廠廢液深度脫氮技術。本文以新型生物高分子3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯的共聚物（PHBV）和PHBV-鋸末共混合體為載體，構建了固相反硝化系統，通過中試試驗對污水處理廠（WWTPs）廢液進行深度脫氮，并通過宏基因組測序分析共混物碳源對微生物群落結構、功能和代謝途徑的影響。與PHBV系統相比，PHBV-鋸末共混物系統的反硝化處理效果更優：NO3?-N去除率更高（96.58%）、DOC釋放量（9.00±4.16 mgL?1）和NH4+-N積累量（0.37±0.32 mgL?1）更低。宏基因組分析證實了兩個系統間微生物群落結構存在顯著差異，并發現了四種厭氧氨氧化菌的存在。與PHBV系統相比，PHBV-鋸末共混物系統的利用降低了產NH4+-N相關酶編碼基因的相對豐度，增加了參與厭氧氨氧化相關酶編碼基因的相對豐度，這有助于降低廢液中的NH4+-N的含量。另外，在PHBV-鋸末共混物系統中，產生電子的糖酵解代謝過程的酶編碼基因的相對豐度更高。在PHBV-鋸末共混物系統中，多種木質纖維素酶編碼基因顯著富集，保證了該系統的穩定供碳和連續運行。本研究結果有望為固相反硝化技術的推廣提供理論依據和數據支持。

論文ID

原名：Metagenomic analyses of microbial structure and metabolic pathway in solid-phase denitrification systems for advanced nitrogen removal of waste water treatment plant effluent: Apilot-scale study

譯名：固相反硝化系統中微生物結構及代謝途徑的宏基因組分析：基于污水處理廠廢水深度脫氮的中試研究

期刊：Water Research

IF：9.130

發表時間：2021.3.17

通訊作者：吳為中

通訊作者單位：北京大學環境科學與工程學院環境科學系

實驗設計

本研究在寧波南區污水處理廠，以PHBV和PHBV-鋸末共混合物為生物膜載體和碳源，構建固相反硝化系統。具體構建方法為：PHBV和PHBV-鋸末共混合體分別與8-10 mm的陶粒以3:7的體積比混合均勻，將混合后的基質填充于高100 cm的多孔支撐盤上，以此建立了兩個直徑20 cm、高140 cm的圓柱形聚氯乙烯固相反硝化系統。該系統啟動階段，將污水處理廠廢液與二沉池活性污泥混合后，以1:1的體積比進入固相反硝化系統，進行生物膜培養。之后每天對固相反硝化系統的水質進行分析，5天后，廢液中的NH4⁺-N和NO3^?-N濃度分別低于1.0和2.0 mgL^?1時，標志著固相反硝化系統正式啟動。該系統共計連續運行150天，1-76天固相脫氮系統的水力停留時間（HRT）為3h，77-150天將HRT降至1.5h，以評估脫氮性能的持久性。測得污水處理廠廢液的溶解氧（DO）和pH值分別為4.1-8.0 mgL^?1和5.68-6.95。

每兩天采集一次進水和出水水樣。通過0.45μm醋酸纖維素膜過濾后，分別對水樣中的NH4⁺-N、NO3^?-N、NO2^?-N、溶解有機碳（DOC）等水質指標進行分析。

在系統穩定運行150天時，分別從PHBV和PHBV-鋸末共混物系統中的5個采樣點采集生物膜樣品，每個采樣點取2g均勻混合成一個樣本，分別命名為P和PS。每個樣本有三個生物學重復。提取相應樣品的DNA進行宏基因組測序及分析，以進行微生物群落結構和代謝途徑的研究。

結果與討論

1不同系統的最佳脫氮性能

不同HRT下的脫氮和DOC釋放性能見表1。HRT為3h和1.5h下，進水中的NO3^?-N的平均濃度分別為9.53±1.43mgL^?1和9.94±1.17 mgL^?1，僅檢測到少量NH4⁺-N。HRT為3h時，PHBV和PHBV-鋸末共混物系統的去除率分別為92.36%和96.64%。在PHBV中摻入鋸末，提高了其硝酸鹽的去除率，改善了其生物可利用率，有利于微生物的附著和固體有機碳的生物降解。

相較于PHBV-鋸末共混物系統，PHBV系統的DOC和NH4⁺-N濃度更高。PHBV-鋸末共混物系統的DOC平均濃度為15.49±12.09 mgL^?1，HRT調整至1.5 h后降至9.00±4.16 mgL^?1。HRT調整到1.5h后，PHBV和PHBV-鋸末共混物系統仍然保持了95.57%和96.58%的有效NO3^?-N去除率，表明了固相反硝化系統的穩定運行。PHBV-鋸末共混物系統出水中NH4⁺-N的累積濃度降至0.37±0.32 mgL^?1，遠低于PHBV系統（1.14±0.37 mgL^?1）。

表1. 不同HRT下的固相反硝化系統的脫氮性能

2不同固體碳源對微生物群落結構的影響

通過宏基因組測序，樣品分組

P得到的原始數據量為3.96×10¹⁰raw bases和2.62×10⁸raw reads，樣品分組PS得到的原始數據量為3.75×10¹⁰raw bases 和2.49×10⁸raw reads。NR物種注釋結果顯示：細菌占總物種的97.53%-99.06%，在每個樣本中均占優勢。PHBV-鋸末共混物系統中細菌和病毒的比例顯著低于PHBV系統，而古菌和真核生物的比例在PHBV-鋸末共混物系統中則具有明顯的數量優勢。

PHBV系統和PHBV-鋸末共混物系統中相對豐度大于1.00%的主要門如圖1a所示。分析表明兩個系統在門水平上的微生物群落組成存在顯著差異。兩個系統中均以變形菌門（Proteobacteria）為主，分別占78.96%和50.05%。在PHBV系統中，擬桿菌門（Bacteroidetes）為第二優勢菌門（3.63%），其次為厚壁菌門（Firmicutes）（3.27%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（2.87%）、放線菌門（Actinobacteria）（1.37%）、酸桿菌門（Acidobacteria）（1.24%）和Spirochaetae（1.19%）。在PHBV-鋸末共混物系統中，放線菌門（Actinobacteria）是的第二優勢菌門（10.61%），其次是綠彎菌門（Chloroflexi）（7.36%）、擬桿菌（Bacteroidetes）（5.33%）、浮霉菌門(Planctomycetes)（2.73%）、酸桿菌門（Acidobacteria）（2.65%）、厚壁菌門（Firmicutes）（2.34%）、Ignavibacteriae（2.04%）、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)（2.07%）、藍細菌門（Cyanobacteria）（1.33%）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）（1.40%）和廣古菌門(Euryarchaeota)（1.36%）。變形菌、擬桿菌、放線菌和綠彎菌廣泛存在于城市污水處理系統中，在生物降解中起著重要作用。大多數脫氮細菌隸屬于變形菌門，變形菌在反硝化中起著主導作用。放線菌合成的一些酶可以促進植物生物量中多糖或酚類化合物的分解過程。綠彎菌和擬桿菌被認為具有分解大分子的能力，通常在發酵系統中觀察到。PHBV-鋸末共混物系統中綠彎菌、放線菌和擬桿菌的豐度較高，可能是由于生物量的難降解性所致。值得一提的是，在PHBV-鋸末共混物系統中檢測到廣古菌門，相對豐度為1.36%。玉米秸稈和雞糞中溫發酵系統中主要的菌群是廣古菌、擬桿菌和厚壁菌。此外，廣古菌門含有豐富多樣的產甲烷細菌，它們在厭氧發酵系統中產生甲烷。因此，在PHBV-鋸末共混物系統中，一小部分有機物可能通過厭氧發酵轉化為甲烷，而不是進行反硝化作用。

PHBV系統和PHBV-鋸末共混物系統在屬水平上的微生物群落組成如圖1b所示。在PHBV系統中，脫氯單胞菌屬（Dechloromonas）所占比例最高，達36.91%，其次是脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）（3.82%）、趨磁螺旋菌屬（Magnetospirillum）（2.90%）、Azoarcus（1.56%）、地桿菌屬（Geobacter）（1.20%）、Thaurea（1.19%）、Azonexus（1.16%）和Candidatus Accumulibacter（1.08%）。在PHBV-鋸末共混物系統中，脫氯單胞菌屬（Dechloromonas）的數量最多，占3.00%，其次是Sulfuritalea（2.64%）、緩生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）（1.96%）、Ignavibacterium（1.81%）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）（1.51%）、Candidatus Accumulibacter（1.46%）、Conexibacter（1.31%）和硝化螺旋菌屬（Nitrospira）（1.23%）。脫氯單胞菌屬（Dechloromonas）,Thauera,Ignavibacterium和硝化螺旋菌屬（Nitrospira）能夠代謝氮和芳香化合物，這在污水處理系統中很常見。脫氯單胞菌屬（Dechloromonas）是固相反硝化菌，可以利用木質纖維素作為碳源。脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）普遍存在于厭氧系統中，能夠參與DNRA。

圖1. PHBV和PHBV-鋸末共混物系統在門（a）和屬（b）水平上的微生物組成。

PHBV和PHBV-鋸末共混物系統中微生物組成的差異分析如圖2所示。在前15個門中，只有變形桿菌門（Proteobacteria）和Spirochaetae在PHBV系統中的相對豐度顯著較高，而其他門主要分布在PHBV-鋸末共混物系統中。前15個屬中，脫氯單胞菌屬（Dechloromonas）, 脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）, 趨磁螺旋菌屬（Magnetospirillum）,Azoarcus, 地桿菌屬（Geobacter）和假單胞菌屬(Pseudomonos)在PHBV系統中顯著富集。

圖2. PHBV和PHBV-鋸末共混物系統在門（a）和屬（b）水平上微生物組成的差異分析。

星號（?）表示與對照組的顯著差異（單因素方差分析，p<0.05）。

之前的研究表明，PHBV-鋸末共混物系統中nirS和amx基因有明顯的富集，因此推測該系統中反硝化和厭氧氨氧化可能有共存的現象，這有助于更好地控制氮和溶解有機碳的含量。在本研究中，NR物種注釋的結果表明PHBV和PHBV-鋸末共混物系統中存在厭氧氨氧化細菌，包括CandidatusBrocadia,Candidatus Kuenenia,Candidatus Scalindua和CandidatusJettenia（圖3）。在PHBV-鋸末共混物系統中，CandidatusBrocadia是相對豐度最高（0.09%）的一種厭氧氨氧化菌，而其他厭氧氨氧化細菌的相對豐度較低（約為0.03%）。此外，所有檢測到的厭氧氨氧化菌在PHBV-鋸末共混物系統中的相對豐度明顯高于PHBV系統，證實了反硝化作用與厭氧氨氧化的協同作用，PHBV-鋸末共混物系統中的厭氧氨氧化活性更高，有利于降低系統出水中累積的NH4⁺-N。

圖3. PHBV與PHBV-鋸末共混物系統中厭氧氨氧化細菌豐度的差異分析。

星號（?）表示與對照組的顯著差異（單因素方差分析，p<0.05）。

3不同固體碳源對氮代謝和糖酵解途徑的影響

氮代謝相關酶編碼基因的相對豐度如圖

4所示。在反硝化途徑中，編碼硝酸還原酶（EC 1.7.5.1）、一氧化氮還原酶（EC 1.7.2.5）和一氧化二氮還原酶（EC 1.7.2.4）的基因在PHBV-鋸末共混物系統中的相對豐度顯著較高，表明其對硝酸鹽的去除效果較好，與出水中較低的NO3?-N相一致。PHBV系統中編碼NH4+-N生成的基因固氮酶（EC1.18.6.1）和羥胺還原酶（EC1.7.99.1）基因相對豐度顯著增加，導致出水中NH4+-N的積累。在PHBV-鋸末共混物系統中，負責調節厭氧氨氧化的肼合酶（EC 1.7.2.7）和肼脫氫酶（EC 1.7.2.8）編碼基因的相對豐度顯著高于PHBV系統，調節NH4+-N生成的編碼基因豐度相對減少，而調節厭氧氨氧化作用的編碼基因豐度相對增加，最終導致出水中NH4+-N的積累減少。

圖4. 氮代謝和糖酵解關鍵酶編碼基因的相對豐度。

星號（?）表示與對照組的顯著差異（單因素方差分析，p<0.05）。

反硝化微生物通過降解碳源獲得電子，保證NO3^?-N完全還原為N2。在糖酵解過程中，葡萄糖激酶（GK，EC 2.7.1.2）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，EC 1.2.1.59）是催化產生反硝化電子供體的兩種重要酶。在糖酵解代謝途徑中，編碼葡萄糖激酶的基因在PHBV系統中的相對豐度（2.73%）顯著高于PHBV-鋸末共混物系統的（2.47%）。葡萄糖激酶負責催化葡萄糖轉化為葡萄糖-6-磷酸，這是碳源代謝的第一步。當固體碳源水解速率過快時，這可能會加速碳源的水解，并導致PHBV系統出水的DOC升高（表1）。PHBV-鋸末共混物系統GAPDH編碼基因相對豐度（EC 1.2.1.59）為0.18%，顯著高于PHBV系統的（0.04%）。GAPDH可催化糖酵解過程中甘油醛-3-磷酸轉化為3-磷酸甘油酯，并生成NADH，作為微生物反硝化的電子供體。因此，在PHBV-鋸末共混物系統中，為硝酸鹽的去除提供更多的電子供體，這與PHBV-鋸末共混物系統具有更好的硝酸鹽去除性能相一致。

而PHBV系統中磷酸甘油激酶（EC 2.7.2.3）和丙酮酸激酶（EC 2.7.1.40）編碼基因的相對豐度（分別為3.49%和3.63%）明顯高于PHBV-鋸末共混物系統的（分別為2.64%和3.39%）。作為催化ATP生成的關鍵酶，其編碼基因的相對豐度明顯較高，可能為PHBV系統中的微生物硝化作用提供更多有效的ATP，而固相反硝化系統中相對較低的DO抑制了微生物硝化作用。

微生物反硝化需要足夠的電子來完成硝酸鹽異化還原為氮的過程。PHBV-鋸末共混物的利用保證了NADH的供應，為微生物脫氮提供了足夠的電子。而PHBV系統出水DOC濃度升高，促進了DNRA生物的生長，但抑制了厭氧氨氧化菌的繁殖，并導致出水中NH4⁺-N的積累。

4不同系統中注釋的木質纖維素酶

PHBV系統和PHBV-鋸末共混物系統中注釋的木質纖維素酶的相對豐度及其差異分析如圖5所示。分別對兩個系統中的10種木質纖維素酶進行了注釋，包括5種纖維素酶（β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、α-葡萄糖苷酶、纖維二糖磷酸化酶和纖維素1,4-β-纖維二糖苷酶）、4種半纖維素酶（β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶）、1種木質素水解酶（半乳糖氧化酶）。除纖維二糖磷酸化酶和半乳糖氧化酶外，大部分木質纖維素酶顯著富集在PHBV-鋸末共混物系統中。表明該系統中木質纖維素的降解更加活躍，不僅提高了資源利用率，而且防止了固相反硝化系統的堵塞，保證了異養反硝化反應穩定的碳源供應。

圖5. PHBV與PHBV-鋸末共混物系統中注釋的木質纖維素酶的相對豐度及其差異。

星號（?）表示與對照組的顯著差異（單因素方差分析，p<0.05）。

結論

以PHBV-鋸末共混物為載體的中試規模的固相脫氮系統成功地實現了污水處理廠廢液的深度脫氮，其負面影響小于PHBV系統。宏基因組分析表明，在PHBV-鋸末共混物系統中，調節NH4⁺-N產生的編碼基因豐度相對減少，而調節厭氧氨氧化作用的編碼基因豐度相對增加，最終導致系統出水中NH4⁺-N積累減少。與PHBV相比，PHBV-鋸末共混物系統中GAPDH（EC 1.2.1.59）編碼基因的相對親和力顯著提高，促進了微生物的反硝化作用。PHBV-鋸末共混物系統中木質纖維素酶編碼基因的顯著富集表明木質纖維素酶的降解更為活躍，從而保證了碳源的持久供應和固相反硝化系統的穩定運行。本研究首次以PHBV-鋸末共混物為載體構建固體反硝化系統，通過中試試驗對污水處理廠廢液進行深度脫氮，并對該系統中微生物代謝機理進行了研究，為天然生物材料的高效利用以及生物共混合碳源對氮代謝的影響提供了新的思路。

原標題：北大 | Water Research：固相反硝化系統中微生物結構及代謝途徑的宏基因組分析：基于污水處理廠廢水深度脫氮的中試研究

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