為研究再生水回用過程中的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)兩座城鎮(zhèn)污水處理廠再生水樣品中人源微生物污染、耐氯大腸桿菌分布及細(xì)菌耐藥性情況進(jìn)行調(diào)查分析。結(jié)果顯示，85.7%的再生水樣品存在人源微生物污染風(fēng)險(xiǎn)；再生水中共分離到8株耐氯大腸桿菌，占所分離大腸桿菌的20% (8/40)，為我國(guó)首次報(bào)道該菌存在，該菌的出現(xiàn)對(duì)水處理過程中微生物的有效消殺提出了挑戰(zhàn)；50%(20/40)的大腸桿菌至少耐受一種抗生素，10%耐受至少3中抗生素，3株大腸桿菌呈ESBL陽性，說明再生水具有耐藥性細(xì)菌傳播風(fēng)險(xiǎn)。因此，污水處理廠應(yīng)優(yōu)化處理工藝，提高對(duì)耐氯菌的消殺水平，并通過多部門聯(lián)合治理以控制耐藥菌傳播，提高再生水的生物安全性。

污水再生回用是緩解水資源短缺的有效途徑，目前再生水已被用于城市景觀、農(nóng)田灌溉、地下水回灌、工業(yè)冷卻水、洗車等。然而再生水中可能含有多種病原微生物（如病毒、細(xì)菌、寄生蟲等），因此保障再生水的生物安全性至關(guān)重要。

再生水生產(chǎn)工藝包含多種微生物去除手段，其中物理手段包括膜過濾、紫外線，化學(xué)手段主要包括加氯消毒及臭氧消毒。氯消毒方式應(yīng)用較為廣泛，它主要利用次氯酸（HClO）和二氧化氯（ClO2）的氧化特性，破壞微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA和RNA等，達(dá)到殺菌效果。Zhi等人的前期研究發(fā)現(xiàn)污水中存在高耐氯菌，這類菌株還攜帶耐熱基因，具有很強(qiáng)的耐熱性，同時(shí)攜帶特異性DNA標(biāo)記uspc-IS30-flhDC。這些耐氯菌株的出現(xiàn)將降低氯消毒的殺菌效果，威脅再生水的生物安全性。

再生水中細(xì)菌耐藥性問題也是目前關(guān)注熱點(diǎn)。污水中含有大量的微生物，為基因水平轉(zhuǎn)移（HGT）提供了良好環(huán)境。通過HGT，抗性基因可傳遞到某些致病菌中，反之毒力基因也可傳遞到抗性菌中，促進(jìn)了抗性致病菌的出現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，氯消毒可提高污水所含抗生素基因含量這些都對(duì)再生水的微生物安全造成巨大挑戰(zhàn)，若處理不當(dāng)則可成為耐藥菌傳播的源頭。為此，以寧波市兩家污水處理廠的再生水為例，調(diào)查其進(jìn)水及再生水中是否存在耐氯大腸桿菌，并測(cè)定再生水中大腸桿菌的耐藥性，了解細(xì)菌耐藥情況。

01 水樣來源及處理工藝

選取寧波市兩座污水處理廠(A廠和B廠)，采集進(jìn)水及再生水水樣。兩廠進(jìn)水主要為生活污水，A廠采用高效沉淀池+濾布濾池工藝，經(jīng)紫外消毒后回用，B廠采用MBR+D型濾池工藝，經(jīng)紫外消毒后回用。

02 結(jié)果

2.1 再生水廠日常檢測(cè)指標(biāo)

為保障再生水回用安全，我國(guó)已出臺(tái)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)再生水用于農(nóng)田灌溉、景觀環(huán)境、工業(yè)及城市雜用（如沖廁、消防、車輛沖洗等）作了規(guī)定。A、B兩座污水處理廠所產(chǎn)再生水的常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)如表1所示，均達(dá)到了《城市污水再生利用 景觀環(huán)境用水水質(zhì)》（GB/T 18921—2019）要求。

由表1可知，兩廠所產(chǎn)再生水中的糞大腸菌群指標(biāo)遠(yuǎn)小于農(nóng)業(yè)灌溉用水、景觀用水、工業(yè)用水的限值要求。因此從生物安全性角度，其不僅可用于河道補(bǔ)給，還可拓展應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)及景觀用水。然而《城市污水再生利用 城市雜用水水質(zhì)》中要求大腸桿菌不能檢出，因此目前兩廠所產(chǎn)再生水不能直接用于沖廁、車輛沖洗、城市綠化、道路清掃、消防、建筑施工等城市雜用。

2.2 進(jìn)出水人源微生物污染檢出率

經(jīng)測(cè)定，所有進(jìn)水樣品均檢出人源微生物污染HF183分子標(biāo)記，即檢出率為100%。14個(gè)再生水樣品中共有12個(gè)檢出人源微生物污染HF183分子標(biāo)記，即檢出率為85.7%，其中A廠檢出率為100%，B廠檢出率為71.4%，表明兩廠再生水中存在人源微生物污染可能性。

2.3 再生水廠進(jìn)出水耐氯菌的檢出率

14個(gè)污水處理廠進(jìn)水水樣共有7份樣品檢出耐氯大腸桿菌uspc-IS30-flhDC分子標(biāo)記，檢出率為50%，其中A廠檢出率為42.9%（3/7），B廠檢出率為57.1%（4/7）。14份再生水樣品中共有2份檢測(cè)出含有耐氯大腸桿菌uspc-IS30-flhDC分子標(biāo)記，檢出率為14.3%，其中A廠和B廠的檢出率均為14.3%。

A廠7份再生水樣品中僅有3份樣品有菌落生長(zhǎng)，但菌落特征顯示全部為非糞大腸菌群菌落。B廠7份樣品全部長(zhǎng)出糞大腸菌群菌落，通過分離鑒定共獲得40株大腸桿菌，其中耐氯大腸桿菌8株。耐氯菌株來自6份再生水樣品，因此再生水耐氯大腸桿菌總檢出率為42.9%（6/14），6份樣品全部來自B廠，B廠的耐氯大腸桿菌總檢出率為85.7%（6/7）。該結(jié)果表明， A廠所產(chǎn)再生水具有較高的生物安全性。然而在采樣期間B廠加氯設(shè)備未運(yùn)行，僅使用紫外一種消毒方式，工藝流程的差異可能導(dǎo)致了A廠所產(chǎn)再生水水質(zhì)優(yōu)于B廠，未能從A廠再生水樣品中分離到大腸桿菌。

兩廠14份再生水樣品DNA中僅有2份含耐氯大腸桿菌uspc-IS30-flhDC分子標(biāo)記，然而，通過對(duì)相同14份再生水樣品過濾膜并在MFC培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)糞大腸菌群后，共從6份樣品中分離得到耐氯大腸桿菌。導(dǎo)致出現(xiàn)上述差異的原因可能是在對(duì)樣品進(jìn)行選擇性培養(yǎng)后，大腸桿菌數(shù)量大量增加，因此分離得到耐氯大腸桿菌的概率增大。該結(jié)果提示可通過對(duì)樣品前處理，增加選擇性培養(yǎng)步驟，提高耐氯菌的分離率。

2.4 再生水中大腸桿菌耐藥性

本研究所分離40株大腸桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥率最高為40%，其次為復(fù)方磺胺(20%)、環(huán)丙沙星(15%)、ESBL(7.5%)、阿莫西林/克拉維酸(7.5%)、頭孢曲松(7.5%)、頭孢西丁(5%)、氨曲南(5%)、左旋氧氟沙星(5%)、慶大霉素(2.5%)、呋喃妥因(2.5%)，見表2。分離得到的大腸桿菌50%至少耐受1種抗生素，5株菌耐受2種抗生素，耐受4種和5種抗生素的菌株各1株，耐受8種抗生素的菌株共2株。40株大腸桿菌中的8株耐氯菌，僅有2株對(duì)氨芐西林耐受，1株對(duì)復(fù)方磺胺耐受，其余5株對(duì)所有抗生素敏感。

03 討論

近年來，隨著城市人口劇增和經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，全球水資源嚴(yán)重不足。與此同時(shí)，全球變暖導(dǎo)致的極端氣候頻發(fā)愈發(fā)加劇了水資源短缺。再生水作為緩解水危機(jī)的重要途徑之一，不僅可用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及市政雜用，在國(guó)外某些缺水地區(qū)甚至已嘗試將再生水用作生活飲用水間接補(bǔ)充水源。然而再生水水源含有大量污染物，因此在其回用過程中不僅存在化學(xué)性危害風(fēng)險(xiǎn)，其所攜帶的病原微生物對(duì)人類的生物安全性風(fēng)險(xiǎn)也不容忽視。

研究發(fā)現(xiàn)，在A廠一些再生水樣品中未能檢測(cè)到糞大腸菌群，然而這些樣品均含有人源微生物污染標(biāo)記物HF183，存在攜帶致病微生物風(fēng)險(xiǎn)，說明僅檢測(cè)糞大腸菌群不能對(duì)再生水安全性進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估。Harwood等人的研究也顯示僅使用個(gè)別腸道指示菌（如總大腸菌群、糞大腸菌群、糞腸球菌等）無法準(zhǔn)確反映再生水中致病微生物情況。目前我國(guó)多項(xiàng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)將檢測(cè)糞大腸菌群作為再生水生物安全性評(píng)價(jià)唯一手段，急需引入其他檢測(cè)方法，提高再生水生物安全評(píng)估技術(shù)水平。隨著測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)的發(fā)展，使用宏基因組技術(shù)對(duì)樣品中所有微生物進(jìn)行檢測(cè)，在經(jīng)濟(jì)和技術(shù)層面的實(shí)施性已完全具備。宏基因組技術(shù)通過測(cè)定樣品中全部核酸序列，可對(duì)樣品中所有微生物的種類及豐度進(jìn)行鑒定。因此可將宏基因組技術(shù)應(yīng)用到再生水回用領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)對(duì)其生物安全性的全面精確評(píng)估。

為保障出水生物安全性，污水處理廠水質(zhì)凈化過程需包括消毒處理，加入氯消毒劑為最常用消毒手段。目前我國(guó)氯消毒劑使用量非常巨大，那么在氯消毒劑的巨量使用所提供的強(qiáng)大進(jìn)化選擇壓力下，是否會(huì)出現(xiàn)耐氯處理致病微生物？大量研究證明，當(dāng)暴露于有害環(huán)境因素后，細(xì)菌基因組的高可塑性，使其可進(jìn)化出抵御機(jī)制來保障自身正常生存繁殖，例如細(xì)菌的耐抗生素、耐重金屬、耐熱性等特性便可通過基因突變或獲取外源抗性基因獲得。因此大量的氯暴露，必然導(dǎo)致耐氯菌的出現(xiàn)。作者前期研究便發(fā)現(xiàn)一些大腸桿菌更適應(yīng)在污水中生存，這些大腸桿菌對(duì)氯的抗性高達(dá)標(biāo)準(zhǔn)菌株的100倍，并攜帶一個(gè)特異性DNA標(biāo)記uspC-IS30-flhDC。目前已在加拿大、瑞士、美國(guó)污水中發(fā)現(xiàn)該類耐氯大腸桿菌。本研究中，B廠7份樣品耐氯大腸桿菌檢出率達(dá)85.7%（6/7），說明本地污水系統(tǒng)中存在耐氯大腸桿菌，為首次在我國(guó)報(bào)道此菌，說明該菌已在全世界范圍流行。該菌株的耐氯性和耐熱性分別為普通菌株的100倍和100萬倍，更易逃過消毒處理，對(duì)水處理效率造成挑戰(zhàn)。同時(shí)細(xì)菌耐氯性與其感染宿主的能力呈正相關(guān)，因此該類菌可能更容易突破人體免疫防御系統(tǒng)，危害人類健康，危及再生水生物安全。

本研究并未從A廠分離到耐氯大腸桿菌。A廠使用氯消毒及紫外消毒兩種消毒方式，而B廠在采樣期間僅使用紫外消毒，因此B廠再生水中大腸桿菌含量相對(duì)較高，提高了分離到耐氯大腸桿菌的幾率。盡管耐氯大腸桿菌可降低氯消毒效力，本研究顯示A廠所使用的紫外線+氯消毒工藝仍可對(duì)其有效去除。多項(xiàng)研究證明，采用聯(lián)合消毒工藝，如氯消毒+紫外消毒，可通過彌補(bǔ)各自工藝不足，提高對(duì)病毒、細(xì)菌芽孢、寄生蟲的殺滅效果。因此為保障再生水生物安全性，建議聯(lián)用多種消毒工藝，以提高消毒效果。

污水中含有大量微生物，是細(xì)菌耐藥性傳播的重要場(chǎng)所。研究發(fā)現(xiàn)，處理后污水排入環(huán)境后，可導(dǎo)致下游水體耐藥基因濃度升高。因此再生水回用過程中，需關(guān)注其耐藥基因攜帶情況，防止再生水成為耐藥基因傳播媒介。Blaak等人發(fā)現(xiàn)污水廠出水中69%大腸桿菌菌株對(duì)所測(cè)8種抗生素敏感，而Craddock等發(fā)現(xiàn)某再生水系統(tǒng)出水中71.4%的菌株對(duì)所測(cè)24種抗生素敏感。本研究所分離大腸桿菌中50%對(duì)所有21種抗生素敏感，但僅有10%菌株耐受3種以上抗生素，因此寧波市再生水中細(xì)菌耐藥性問題尚不突出。然而，本研究共分離到3株產(chǎn)ESBL大腸桿菌，ESBL可使菌株耐受多種β-內(nèi)酰胺類抗生素，包括第三代頭孢菌素和單酰胺環(huán)類抗生素，且ESBL菌株常同時(shí)耐受其他類抗生素。產(chǎn)ESBL菌株目前在全世界流行性不斷上升，相關(guān)部門應(yīng)當(dāng)給予高度重視，加強(qiáng)臨床治療及養(yǎng)殖中抗生素使用的監(jiān)管，控制耐藥菌產(chǎn)生和傳播。同時(shí)再生水回用中也需關(guān)注此類菌株的存在情況，研究開發(fā)新型殺菌技術(shù)，降低其通過再生水傳播感染人類風(fēng)險(xiǎn)。

04 結(jié)論

寧波兩座污水處理廠所產(chǎn)再生水符合國(guó)家再生水回用河道標(biāo)準(zhǔn)，從再生水中共分離到8株耐氯大腸桿菌，在我國(guó)尚屬首次報(bào)道。該菌的出現(xiàn)對(duì)水處理過程微生物的有效消殺提出了挑戰(zhàn)，水務(wù)部門需優(yōu)化處理工藝，提高消毒水平。同時(shí)，分離到多株耐藥大腸桿菌，其中包含耐ESBL菌株，它們的出現(xiàn)會(huì)威脅再生水回用中的生物安全，相關(guān)部門應(yīng)對(duì)細(xì)菌耐藥性進(jìn)行聯(lián)合治理，從源頭控制耐藥菌的產(chǎn)生，從傳播鏈控制耐藥菌的擴(kuò)散，保障人類健康。

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